Jornal de Farmacogenômica e Farmacoproteômica

Abstrato

Verificação de métodos de isolamento de ADN para análise NGS-HERC

Vanja Raščanec

Objetivo de base: O sequenciamento de nova geração (NGS) em oncologia começa com material de amostra inicial de alta qualidade para obter resultados NGS fiáveis ​​e posteriormente uma análise de dados precisa. Aqui apresentamos uma breve verificação dos dados do fabricante de três métodos diferentes de isolamento de ADN da mesma amostra em que o rendimento do ADN se correlaciona com o número de linfócitos. Métodos: Foram colhidas amostras de sangue total em tubos de EDTA de doentes encaminhados para teste NGS Hereditary Cancer Panel (HERC) na plataforma Illumina MiSeq. Disponibilizamos números de 30 pacientes. O número de linfócitos foi determinado no analisador Sysmex XN-1000. O ADN foi isolado a partir de 200 µL de sangue total ou camada leucocitária utilizando o kit Qiagen QiaAmp DNA Blood Mini Kit para isolamento de ADN e também de sangue total no QIAcube. A concentração foi medida no espectrofotómetro NanoDrop™ Lite e no Qubit4. Resultados: De acordo com os resultados obtidos, estabelecemos o protocolo de utilização do método ideal de isolamento de ADN para análise de NGS em doentes oncológicos. Comparámos a concentração de ADN de três amostras e métodos iniciais diferentes. Se a contagem de linfócitos for inferior a 1,0 x 109/L, a amostra ideal é a camada leucocitária e o método QiaAmp. Se a contagem de linfócitos estiver entre 1,0 e 2,5x109/L, a amostra ideal é o sangue total e o método QiaAmp. Nos casos em que a contagem de linfócitos é superior a 2,5x109/L, o isolamento QIAcube pode ser processado para obter ADN de alta qualidade e uma concentração mínima de 30 ng/µl de ADN suficiente para a análise NGS que se segue. Conclusão: Considerando o número potencialmente baixo de linfócitos em doentes oncológicos, desenvolvemos um protocolo ideal para o isolamento de ADN utilizando diferentes amostras e métodos iniciais para garantir uma amostra de ADN válida para análise NGS.