Bioquímica e Bioquímica Analítica

Abstrato

O uso de diclorofluoresceína como sonda para monitorizar os efeitos do cálcio na produção de ERO nas mitocôndrias

Olga V Akopova, Liudmila Kolchinskaya e Valentina Nosar

A diclorofluoresceína (DCF) é amplamente aplicada para monitorizar a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) em células e mitocôndrias isoladas. O nosso objetivo foi comparar diferentes abordagens para a utilização de DCF para monitorizar a formação de ERO acompanhando o transporte de Ca2+ em mitocôndrias isoladas. Os efeitos do Ca2+ na produção de ERO foram estudados em mitocôndrias cerebrais e hepáticas de ratos utilizando dois modos de aplicação de DCF: o primeiro foi o pré-carregamento da suspensão mitocondrial de stock com o precursor de DCF diacetato de diclorofluoresceína (DCFDA), e o outro foi a adição de alíquotas de DCFDA diretamente ao o meio de incubação. O cálcio aumentou a produção de ERO nas mitocôndrias do cérebro e do fígado, tanto em condições de estado estacionário como de não equilíbrio, causadas pela libertação gradual do citocromo c e pelo bloqueio do fluxo de eletrões. Utilizando mitocôndrias pré-carregadas com DCF, mostrámos que a taxa de formação de ERO em condições de estado estacionário era linearmente dependente da taxa de ciclagem de Ca2+ e da respiração estimulada por Ca2+. A transição para o estado de não equilíbrio resultou no aumento não linear da formação de ERO, que também exibiu dependência da concentração de Ca2+. Enquanto nas mitocôndrias pré-carregadas com DCF a fluorescência do DCF seguiu de perto o curso do transporte de Ca2+, nas mitocôndrias descarregadas o carregamento da sonda interferiu com a deteção da formação de ERO devido à mudança contínua da concentração de DCF no espaço da matriz. Com base nas experiências, chegámos à conclusão que o DCF pré-carregado nas mitocôndrias poderia servir como uma sonda adequada para monitorizar os efeitos do transporte de Ca2+ na produção de ERO.