Jornal de Pesquisa e Terapêutica Biomolecular

Abstrato

A purificação simultânea de FVIII/vWF humano e a inativação de vírus combinadas numa coluna cromatográfica

Sergiy P Havryliuk, Ievgenia M Krasnobryzha, Olena S Havryliuk e Georgii L Volkov

É sabido que a diminuição do número de graus de liberdade impede a desnaturação das proteínas. Na investigação anterior, mostrámos que a proteína de ligação ao gel cromatográfico pode servir como agente redutor do número de graus de liberdade da proteína. Além disso, a elevada capacidade dinâmica dos novos géis desenvolvidos proporcionou uma retenção satisfatória do peptídeo/proteína a elevada temperatura do processo cromatográfico. Estes dois fatores permitiram a implementação da inativação do vírus para o peptídeo (fragmento de estreptoquinase SK1-61) e proteína de baixo peso molecular (lisozima do leite) e médio (enzima fibrinogenolítica do veneno de cobra) diretamente na coluna durante o isolamento dos alvos . O objetivo deste estudo foi investigar a possibilidade de salvar a atividade do complexo de alto peso molecular FVIII/vWF, ligado por troca iónica e géis de afinidade durante a inativação do vírus diretamente na coluna cromatográfica. Outro objectivo foi mostrar que o adsorvente da proteína de ligação pode servir como um “crivo” fiável para a lavagem mecânica de vírus infectantes. Utilizando várias abordagens cromatográficas, fotométricas e de RT-PCR, descobriu-se que a elevada capacidade dinâmica, que determina a elevada capacidade dependente da temperatura do adsorvente, permitiu realizar o complexo inativador de vírus FVIII/vWF por tratamento com solvente/detergente diretamente no coluna cromatográfica à temperatura de 40-50°C durante um longo período de 3-5 horas. A atividade biológica do FVIII foi completamente preservada; vírus com e sem envelope foram efetivamente removidos. O nível de eliminação do vírus modelado foi suficiente para uma inativação completa dos vírus, o que nos permitiu recomendar este método para utilização na indústria farmacêutica.