Jornal de tecnologia microbiana e bioquímica

Abstrato

Os efeitos dos pré-tratamentos na deteção de bactérias qPCR - indicador de bactérias, Enterococcus como modelo

Shin Giek Goh e Karina Yew-Hoong Gin

As actuais directrizes sobre águas recreativas (por exemplo, USEPA e OMS) recomendam enterococos como indicador tanto para águas doces como para águas marinhas. O método baseado na cultura tem sido utilizado há décadas para quantificar a presença de enterococos. No ano de 2012, a diretiva da USEPA para águas de recreio incluiu a qPCR como método alternativo para detetar enterococos. O método qPCR não requer um tempo de incubação longo como o método baseado na cultura. Além disso, oferece as vantagens de uma elevada especificidade e deteção de sensibilidade. No entanto, o qPCR é prejudicado por três fatores limitantes principais. Existem células-alvo limitadas num pequeno volume de amostra a ser analisada por qPCR, a presença de inibidores que podem facilmente afetar a deteção sensível de qPCR e a persistência de ADN livre (ADN libertado de células mortas) que causou o sinal falso positivo em qPCR . Como tal, os tratamentos a montante são cruciais para a precisão da deteção de qPCR. Três métodos diferentes de pré-concentração (i) filtração com membrana de nylon; (ii) filtração com membrana de policarbonato e (ii) centrifugação, foram examinados quanto à sua taxa de recuperação. Verificou-se que a filtração com membrana de policarbonato proporciona uma maior eficiência de recuperação e resultados de consistência, independentemente das matrizes da amostra. A extração convencional de ADN e dois kits de extração de ADN disponíveis comercialmente foram avaliados de acordo com a pureza do ADN extraído e a relativa eficiência de recuperação da extração. Os resultados mostram que o kit comercial, QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen), apresentou o melhor desempenho. Está provado que a aplicação de membranas de sílica no QIAamp® DNA Mini Kit melhora a recuperação do ADN com interferência mínima de inibidores. A monoazida de etídio (EMA) e a monoazida de propídio (PMA) foram avaliadas quanto ao seu desempenho na redução do sinal falso-positivo em qPCR. O PMA parece fornecer a melhor opção para reduzir a deteção de falsos positivos de ADN numa célula comprometida pela membrana.