Jornal de Patologia Vegetal e Microbiologia

Abstrato

Detecção específica de Klebsiella variicola e K. oxytoca por amplificação isotérmica mediada por loop

Jarred Yasuhara-Bell, Caleb Ayin, April Hatada, Yonghoon Yoo, Robert L. Schlub e Anne M. Alvarez

Klebsiella spp. são patógenos oportunistas com isolados clínicos, veterinários e associados a plantas. Um estudo anterior mostrou que o lodo bacteriano de madeira úmida de árvores de pau-ferro severamente declinadas em Guam continha Ralstonia solanacearum , Klebsiella variicola e K. oxytoca. Neste estudo, a Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (LAMP) detectou K. variicola e K. oxytoca especificamente, usando conjuntos de primers exclusivos projetados individualmente para cada organismo. Cada LAMP detectou seu alvo especificamente, enquanto mostrou resultados negativos para bactérias não alvo e controles negativos. O LAMP detectou Klebsiella em tecidos de caule de pau-ferro inoculados e lodo bacteriano. Devido à presença de inibidores de plantas, diferentes protocolos de amostragem foram testados. A imersão de amostras de tecido vegetal para permitir a difusão de bactérias na solução, seguida de fervura, forneceu a detecção ideal de Klebsiella diretamente de amostras de plantas. Os falsos negativos obtidos ao usar amostras de plantas trituradas foram eliminados pela inclusão de uma etapa de enriquecimento, envolvendo plaqueamento e incubação de 12 horas. DGGE (eletroforese em gel de gradiente desnaturante) e um imunoensaio de colônia-blot usando um anticorpo específico para Klebsiella também detectaram Klebsiella em ironwood inoculado. As bandas DGGE e as reações cruzadas de anticorpos de enterobactérias intimamente relacionadas mostraram o potencial para resultados falso-positivos. A natureza do LAMP o torna ideal para testes no ponto de atendimento e, quando combinado com a especificidade dos primers LAMP desenvolvidos neste estudo, demonstra seu potencial como um teste de campo de rotina para Klebsiella em ironwood em Guam, bem como diagnóstico clínico e veterinário de infecção por Klebsiella. Além disso, as regiões alvos para detecção neste estudo têm aplicação em todas as formas de diagnósticos baseados em moléculas.