Tecnologia Genética

Abstrato

Expressão de pró-insulina humana recombinante em E. Coli alterando a região 5ʹ não traduzida e traduzida

Aslam F, Latif K, Waseem R, Naz S e Iftikhar S

O RNA mensageiro inicia o processo de tradução, transferindo o código do ADN para o RNA transportador. Uma sequência rica em polipurinas denominada sequência Shine-Dalgarno ajuda a determinar a posição do códon de início, a sequência Shine-Dalgarno é diferente porque permite que o ribossoma seja construído numa posição interior no mRNA através da ligação direta a esta sequência. Sítio de ligação ribossómica na extremidade 5’ do sítio de iniciação da tradução utilizado para ligar a estrutura secundária do mRNA, a distância entre o RBS e o códon de início afeta a eficiência translacional de um gene. Neste estudo, alterámos a distância entre o local de ligação do ribossoma e o códon inicial para obter as diferentes proporções de expressão translacional. Para tal, gene da pró-insulina clonado no vetor pET21a, a distância entre o sítio de ligação e o códon de partida foi retida em 8 nucleótidos. A esta distância entre o sítio de ligação ao ribossoma (RBS) e o códon de início, a expressão da pró-insulina foi de 30% do total de proteínas celulares. Quando existem 10 nucleótidos entre eles, a expressão diminuiu até 2-4%. Com 12 nucleótidos entre o RBS e o códon de início, a expressão diminuiu ainda mais até 1-2%. Como estas tentativas são feitas de forma aleatória, a verificação das estruturas secundárias do mRNA por M-fold mostrou uma ligação entre o local de ligação do ribossoma e o início do gene da pró-insulina. Outra tentativa foi feita incorporando dez nucleótidos diferentes no início do gene da pró-insulina para tornar a estrutura secundária do mRNA menos estável (ΔG=-5,5) não alterando significativamente a expressão da pró-insulina no códon BL21 mais células. Existem outros factores que controlam a expressão proteica, isto é, a instabilidade metabólica, a rápida degradação do ARNm ou a acumulação de proteínas podem regular negativamente a expressão do ARNm.