Jornal de pesquisa e terapia com células-tronco

Abstrato

Quantificação de progenitores megacariocíticos em produtos de aférese por citometria de fluxo e PCR em tempo real

Leinøe Eva, Nielsen Kaspar R, Baech John, Steffensen Rudi, Dybkaer Karen, Boegsted Martin e Johnsen Hans E

Enquadramento e objetivos: A avaliação da qualidade do transplante autólogo de células estaminais do sangue periférico (PBSCT) pode ser melhorada através da enumeração de progenitores megacariocíticos CD34+/CD61+ dentro do enxerto. A enumeração de subconjuntos por citometria de fluxo (FC) tem sido difícil de padronizar devido à baixa especificidade que pode surgir da adesão de plaquetas ou microesferas. O nosso objetivo foi analisar a adesão plaquetária às células estaminais hematopoiéticas e estabelecer um ensaio quantitativo de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) para os transcritos dos genes CD34 e CD61. A análise foi utilizada para estudar o CD34 e o CD61 como preditores de recuperação tardia de plaquetas após PBSCT no linfoma não-Hodgkin (LNH). Material e métodos: A análise FC foi realizada em produtos de aférese colhidos para transplante autólogo e a microscopia confocal foi aplicada em células selecionadas. A avaliação clínica incluiu a análise dos produtos de leucaferese de 21 doentes consecutivos com LNH tratados com terapêutica em altas doses e PBSCT. A recuperação precoce foi definida como uma contagem de plaquetas observada >20x10(9)/L antes do dia 12 após o transplante e a recuperação tardia como uma contagem de plaquetas observada <20x10(9)/L após o dia 12 após o transplante. Para análise de RT-qPCR, as células CD34 + foram classificadas a partir de produtos de leucaferese descongelados e o RNA foi extraído e transcrito inversamente para cDNA para análise adicional dos níveis de mRNA de CD34 e CD61 utilizando sondas TaqMan. Resultados: As células CD34+/CD61+ identificadas por FC demonstraram formar um subconjunto específico, sem sinais de plaquetas maduras aderentes. As células CD34+/CD61+ expressaram transcritos de mRNA de CD61 não encontrados nas células CD34+/CD61- complementares. Não foi identificada qualquer correlação positiva entre a enumeração baseada na FC e a estimativa da análise RT-qPCR dos subconjuntos de progenitores megacariocíticos . A avaliação do impacto clínico comparando amostras de 21 doentes com recuperação plaquetária precoce e tardia não revelou impacto preditivo para as taxas de expressão CD61/BACT (β-actina), CD34/BACT ou CD61/CD34, taxas de expressão entre as células classificadas CD34+. Conclusão e perspetiva: Um subconjunto específico de células CD34+/CD61+ pode ser identificado por análise de FC e RTqPCR; no entanto, a enumeração deste subconjunto não se correlacionou com a recuperação plaquetária após PBSCT. Estudos futuros sobre o valor preditivo necessitam de ser avaliados num grupo de doentes com falha do enxerto em colaboração internacional dentro do Grupo Europeu de Transplante de Sangue e Medula Óssea (EBMT).