Biologia e Medicina

Abstrato

Complexos Lipopolissacáridos (LPS) e Proteína-LPS: Detecção e Caracterização por Electroforese em Gel, Espectrometria de Massas e Bioensaios

Eugenio Hardy, Caridad Rodriguez e Luis E. Trujillo

Um pré-requisito para a descoberta e caracterização da interação do lipopolissacarídeo (LPS) com recetores específicos e os efeitos fisiopatológicos resultantes é a análise estrutural abrangente das espécies de LPS. Esta breve revisão tem como objetivo resumir a utilização da eletroforese em gel associada a outras tecnologias bioquímicas para deteção e caracterização de LPSs. Os agregados de lipopolissacarídeos isoladamente ou misturas contendo LPSs e proteínas/peptídeos podem ser separados por eletroforese em gel de agarose nativa (NAGE), após a qual os LPSs são detetados com sais de imidazol e zinco. Um processo de dupla coloração com azul brilhante de Coomassie R-250 permite a utilização de NAGE para detetar e estudar interações proteína-LPS. Para análise composicional, os agregados de LPS são separados, com alta resolução, por eletroforese em gel de poliacrilamida-surfactante. Após coloração inversa com zinco-imidazol e eluição a partir de micropartículas de gel, os LPS específicos da glicoforma estão prontos para análise estrutural e biológica. Para a análise de sequências baseada em espectrometria de massa de ionização por eletropulverização em tandem (ESI-MS/MS) de oligossacarídeos, os LPSs são submetidos a hidrólise ácida suave, desfosforilação e permetilação. Além disso, as formas de LPS O-desaciladas podem ser analisadas por dessorção a laser assistida por matriz/tempo de ionização de voo-MS. Em comparação com os espectros dos LPSs não purificados, os espectros de massa dos LPSs micropurificados apresentam uma redução da heterogeneidade e um aumento da relação sinal-ruído. Além disso, a micropurificação do LPS antes da MS permite uma maior sensibilidade de deteção para glicoformas de LPS menos abundantes. As frações de LPS micropurificadas podem ser utilizadas para formar nanoagregados automontados que podem ser detetados por dispersão dinâmica de luz. O efeito do comprimento da cadeia lateral O no potencial Z dos agregados de LPS pode ser estimado por medições baseadas na eletroforese laser Doppler. Os LPS específicos de glicoformas assim obtidos não são apenas quimicamente intactos, mas também biologicamente ativos, como testado, por exemplo, pelo teste de lisado de amebócitos de Limulus, ensaio de TNF-α e efeito agonista no recetor Toll-like 4 humano.