Jornal de pesquisa e terapia com células-tronco

Abstrato

Screens de mutagénese insercional baseados em LINE-1 para identificar genes envolvidos na diferenciação de células estaminais embrionárias

Sung-Hun Lee e Danny Rangasamy

Enquadramento: O conhecimento das propriedades intrínsecas das células estaminais embrionárias é essencial antes que a possibilidade de utilização destas células para fins terapêuticos se torne uma realidade. Os rastreios de mutagénese de inserção são amplamente utilizados para identificar genes suficientes para conferir um fenótipo particular; no entanto, as aplicações de tais abordagens estão limitadas a modelos de ratinhos. Assim, existe a necessidade de desenvolver um novo sistema de transposão de ADN que permita abordagens de descoberta de genes em células estaminais.
Métodos: Este estudo foi realizado para explorar a possibilidade de utilizar o retrotransposão do elemento nuclear longo intercalado 1 (LINE -1) como vetor de armadilha genética para identificar genes envolvidos na manutenção e diferenciação de células estaminais embrionárias de ratinhos.
Resultados: Desenvolvemos um sistema de retrotransposão LINE-1 epissómico e não viral utilizando as regiões de fixação estrutura/matriz na espinha dorsal do nosso vetor. Este vetor de armadilha genética alberga um marcador GFP cuja expressão ocorre apenas após mutagénese de inserção bem-sucedida. Ao utilizar este vector, juntamente com a expressão de GFP, isolámos com sucesso quatro clones individuais de células estaminais embrionárias que apresentam genes interrompidos, incluindo dois genes conhecidos. Em seguida, confirmámos a identidade destes genes utilizando uma abordagem de PCR inversa e verificámos a sua função na diferenciação celular utilizando shRNAs e marcadores indiferenciados de células estaminais embrionárias .
Conclusões: A facilidade de utilização deste mutagénico de inserção e a simplicidade de identificação das células com genes interrompidos pela expressão GFP tornam este vector LINE-1 uma ferramenta promissora para a descoberta de genes de células estaminais embrionárias e células estaminais cancerígenas .