Jornal de pesquisa e terapia com células-tronco

Abstrato

Microdissecção por captura laser de células interzonais murinas: seleção de camadas e previsão do rendimento de RNA

Florien Jenner, Gerjo JVM van Osch, Mairead Cleary, Iris Ribitsch, Ulrich Sauer, René van Weeren e Pieter Brama

Objectivo: Os condrócitos articulares têm origem numa coorte distinta de células progenitoras localizadas na chamada interzona nas articulações em desenvolvimento embrionário. Conduzimos este estudo 1) para determinar se é possível identificar histologicamente as camadas intermédias e externas da interzona (utilizando cresil violeta) sem hibridização in situ adjunta ou imunohistoquímica; 2) estabelecer se podem ser colhidas quantidades suficientes de RNA de cada camada interzonal de embriões individuais para permitir a análise da expressão génica; 3) desenvolver medições que possam fornecer uma estimativa do rendimento de RNA antes de etapas dispendiosas de amplificação. Métodos: Células da interzona externa (OI) e intermédia (II) da articulação femorotibial nascente e da cartilagem epifisária (CE) do fémur e da tíbia de embriões murinos com 13,5 e 15,5 dias de gestação foram colhidas através de microdissecção por captura a laser (LCM). Posteriormente, foi realizada a análise de microarranjos para confirmar a seleção apropriada da camada. A área superficial colhida e o valor de cinzento (gv) das fotomicrografias tiradas durante o LCM foram medidos e a densidade ótica relativa (ROD) correspondente foi calculada e o grau e a significância da correlação com o rendimento de RNA foram determinados. Resultados: As células do OI, II e EC puderam ser identificadas histologicamente através da coloração cresil violeta e foram colhidas com sucesso com LCM produzindo quantidades suficientes de RNA para amplificação linear e análise de microarranjos. O rendimento de RNA correlacionou-se significativamente com a área superficial do tecido colhida, o gv médio e o ROD correspondente. Conclusões: Este estudo fornece uma técnica para a microdissecção seletiva de captura laser e subsequente análise de microarranjos de células interzonais murinas da camada intermédia e externa e apresenta um método para estimar o rendimento de RNA medindo a área de tecido colhida e calculando o ROD. Recomendamos a colheita de um mínimo de 1 × 106 μm2 de embriões murinos de 13,5 dias e 3 × 106 μm2 de embriões murinos de 15,5 dias para obter aproximadamente 10 ng de RNA total que pode ser utilizado para amplificação linear baseada em T7 e subsequente análise de microarranjos.