Bioquímica e Bioquímica Analítica

Abstrato

Eliminação da heparina pelos receptores de eliminação hepática

Edward N. Harris

A gama de tecnologias de ensaio para ligação e sinalização foi desenvolvida nos laboratórios HTS para a identificação de compostos de hit ou de chumbo que atuam em GPCRs. O ensaio de ligação [35S] GTPγS ainda continua a ser uma técnica útil e simples para demonstrar a ativação do recetor e é um dos poucos ensaios funcionais e livres de células. No entanto, a sua natureza radioactiva impõe limitações claras à sua utilização na prática laboratorial regular e em experimentações de alto rendimento. Aqui, desenvolvemos uma nova versão não radioativa do ensaio utilizando análogo de GTP marcado com európio, na qual a ligação európio-GTP pode ser testada utilizando fluorescência resolvida no tempo. Na continuação dos nossos esforços, este ensaio foi adaptado para os receptores de histamina 3. O formato do ensaio foi avaliado especificamente testando medicamentos conhecidos como agonistas da histamina 3 (Imetit, Immepip, Metil-histamina, Proxifan e Histamina) e antagonistas (GSK189254, Clobenpropit e Tioperamida). Em condições de ensaio optimizadas, as potências (pEC50 e PKB) no ensaio de ligação estão em boa concordância com as obtidas anteriormente no ensaio de actividade funcional isotópica. Observou-se que o ensaio de ligação Eu-GTP era altamente robusto (fator Z’ 0,84) com uma percentagem elevada em relação às contagens basais. Este ensaio pode ser utilizado como um componente da cascata de rastreio para o rastreio de antagonistas dos receptores da histamina 3.