Jornal de tecnologia microbiana e bioquímica

Abstrato

Superenrolamento espiralado de ADN e interligação topológica intramolecular

Xitai Huang, Jia Yu, Zhenfeng Zhang e Kou Cao

Observou-se anteriormente que o ADN do cromossoma de Escherichia coli consistia em subunidades de superenrolamento em forma de espiral de Arquimedes. A forma como as células constroem tal estrutura de ADN permanece desconhecida. No presente estudo, as imagens de microscopia de força atómica (AFM) mostraram que o ADN superenrolado do pBR322 forma uma estrutura espiral após intercalação com 0, 5 μg / ml de brometo de etídio (EB), que costumava ser considerado como densidade super-hélice zero. Novas evidências sugeriram que uma nova ligação topológica, a interligação topológica intramolecular (ITL), promove a formação de espiral de ADN. Sem intercalação, o ADN superenrolado do pBR322 exibe um superenrolamento plectonémico com uma distribuição desigual da densidade do superenrolamento. Observação semelhante foi também feita quando o ADN foi demasiado intercalado pelo EB (20 μg/ml). Os resultados indicaram que o ITL funciona como um travão para bloquear a torção das cadeias duplas helicoidais e dividir o ADN circular em diferentes domínios de densidade super-hélice. Quando o ADN foi desnaturado em meio alcalino, as imagens de AFM mostraram que o ITL se mantém constante. À medida que o ADN desnaturado do pBR322 foi cortado com a endonuclease de restrição PstI, o ADN digerido manteve interligações intramoleculares para convergir para um centro com duas extremidades cortadas livres. Podem ser observados intermediários interligados quando o ADN natural do pBR322 foi digerido com HindIII e nickase específica do local Nb. Bpu10I. Todas as evidências sugerem que o ITL está presente no ADN do pBR322 e causa o superenrolamento espiralado do ADN. Verificou-se que os topoisómeros de ADN com diferentes números de ITL formam uma escada de bandas na electroforese que é distinta dos topoisómeros de ADN produzidos pela girase de E. coli formando um esfregaço. Num sistema isento de células contendo extracto de células de E. coli, demonstrámos que a topoisomerase IV é necessária para a produção de topoisómeros de ADN de ITL a partir de substrato de cccDNA relaxado. Coletivamente, os nossos dados sugerem que o ITL representa um novo elemento da estrutura topológica do ADN. O superenrolamento espiralado do ADN pode ser uma estrutura universal presente na célula.