Pharmaceutica Analytica Acta

Abstrato

Desenvolvimento de um ensaio rápido e econômico para a triagem da inibição reversível do citocromo P450 em paralelo com a inibição dependente do metabolismo do Cyp3a4 usando proteínas recombinantes

Serenella Zambon, Stefano Fontana, Raffaele Longhi e Mahmud Kajbaf

No presente estudo, desenvolvemos um ensaio de inibição de CYP450 de alta qualidade, rápido e econômico que tem a capacidade de detectar inibição reversível e dependente do metabolismo (MDI) de CYP3A4, usando isoformas P450 expressas recombinantemente e substratos P450 fluorogênicos. A isoforma CYP3A4 é rastreada com dietoxifluoresceína (DEF) como substrato de sonda. Os valores de IC50 podem então ser calculados para compostos de teste contra a isoforma CYP3A4, com base na taxa de metabolismo do substrato de sonda, medida por 10 minutos. Além disso, o potencial inibitório dependente do metabolismo de CYP3A4 dos compostos de teste é determinado estendendo por 30 minutos a determinação da taxa de metabolismo de dietoxifluoresceína e calculando os valores de IC50 a cada 5 minutos do período de incubação. Uma estimativa do potencial inibitório dependente do metabolismo de CYP3A4 dos compostos de teste pode ser determinada comparando os valores de IC50, medidos após 10 e 30 minutos de incubação. A incubação foi realizada usando os inibidores seletivos de CYP miconazol, para inibição direta de P450, e troleandromicina, para inibição dependente do metabolismo, como controles positivos. Todo o processo de triagem foi totalmente automatizado em formato de placa de 96 poços com o uso da tecnologia de robô de manuseio de líquidos Hamilton acoplada a dois fluorímetros (Tecan) e um gerenciamento personalizado de informações laboratoriais. Este ensaio é atualmente aplicado para rastrear compostos no início do processo de otimização de chumbo e identificar aqueles compostos que causam inibição reversível e/ou baseada no metabolismo do CYP450 e, portanto, progredir essas moléculas ou séries químicas com o menor potencial de DDI possível. O alto número de dados gerados por meio deste ensaio também pode ser usado para construir um banco de dados informativo e melhorar modelos preditivos.