Jornal Global de Biologia, Agricultura e Ciências da Saúde

Abstrato

Desenho, otimização e validação de ensaio de citometria de fluxo para quantificação de Igg-anti-D (rho) no controlo do processo industrial de produção de anti-rho-gamaglobulina

Sérgio A Oviedo, Susana Vitali, Jorge Zarzur

Uma das principais causas da doença hemolítica do recém-nascido deve-se à geração de anticorpos anti-D, em resposta a um desafio antigénico contínuo em mães grávidas que não possuem o antigénio D nos glóbulos vermelhos. Para prevenir complicações, é realizada a monitorização dos níveis de anticorpos anti-D nas grávidas e a sensibilização é prevenida através de profilaxia com imunoglobulina anti-D (IgG anti-D). Até à data, a monitorização e titulação do anti-D no plasma e produtos acabados (IgG anti-D) é realizada por análise de fluxo contínuo com um Autoanalisador Technicon, Radio Immuno Assay (RIA) e Enzymo Immuno Assay (EIA). No nosso laboratório, para a quantificação dos anticorpos anti-D do Gamma-Rho UNC e dos produtos do processo de elaboração, foi desenvolvida uma técnica "house made" de citometria de fluxo como teste alternativo ao método de referência da Farmacopeia Europeia. Foram utilizados anticorpos policlonais anti-Rho e uma IgG humana marcada com anti FITC (isotiocianato de fluoresceína) para medir a concentração de anticorpos anti-D numa preparação comercial de gamaglobulina, semiprocessado e plasma humano. O método foi desenvolvido utilizando o 1º padrão internacional da OMS para IgG anti-D (69/419). Na concentração de glóbulos vermelhos utilizada no método (5 x 104 células/ul) não há interferência por autoaglutinação. A curva dose resposta obtida (MFI vs. Log C) foi linear no intervalo de trabalho adoptado, apresentando um coeficiente de correlação de 0,99. Os testes de especificidade e de recuperação foram satisfatórios, os controlos negativos apresentaram níveis de fluorescência insignificantes e não apresentaram interferências graves na determinação. Sabendo que os níveis de antigénio anti-sítios D pelas hemácias variam de acordo com o fenótipo, os nossos resultados mostram que os glóbulos com fenótipos R1R1 apresentam o melhor desempenho para este teste, podendo ser substituídos se necessário por células R1R2. O método foi validado seguindo os critérios do grupo de Peritos N°6B do NIBSC e da Farmacopeia Europeia que padronizaram um procedimento semelhante para ser aplicado na avaliação do anti-D. A Citometria de Fluxo permitiu obter determinações exactas, precisas, sensíveis e específicas em diferentes concentrações de anti-D (100-0,9 ug/ml) e em diferentes matrizes biológicas como produto acabado, produto concentrado pré-cheio e fracção II do método de Cohn. As vantagens encontradas na aplicação deste método, para além do custo relativamente baixo, incluem um forte sinal de fluorescência que não necessita de amplificação, a utilização de amostras altamente diluídas que minimizam o risco de aglutinação por IgM-Anti D ou polímeros. É um método simples, rápido e fiável para determinar os níveis séricos de anti-D ou quantificar a concentração numa solução de imunoglobulina.