Jornal de Patologia Vegetal e Microbiologia

Abstrato

Ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa de imunocaptura colorimétrica para detecção rápida do vírus Y da batata

Mohammad Amin Almasi e Seyedmohammad Hosseyni Dehabadi

O ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é uma nova técnica para amplificar DNA sob temperatura constante, com alta especificidade, sensibilidade, rapidez e eficiência. Para diminuir o tempo necessário para alguns ensaios de diagnóstico, incluindo PCR de transcrição reversa (RT-PCR), amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) e também DAS-ELISA em um nível mínimo, um protocolo inovador de IC-RT-LAMP e IC-RT-PCR colorimétrico com base no genoma do vírus Y da batata (PVY) foi usado e otimizado. Primeiramente, o ensaio DAS-ELISA foi realizado para detectar o vírus em uma coleção contendo 95 amostras suspeitas. Por fim, cinco amostras foram detectadas como amostras positivas. Em seguida, as amostras positivas foram verificadas por métodos moleculares. A este respeito, todos os quatro primers RT-LAMP (ou seja, F3, B3, FIP e BIP) juntamente com os primers RT-PCR (F e B) foram selecionados com base no gene da proteína de revestimento (CP) do genoma PVY. Embora os ensaios DAS-ELISA, RT-PCR e RT-LAMP pudessem detectar com sucesso amostras positivas de plantas infectadas, considerando o tempo, a segurança, a sensibilidade, o custo e a simplicidade, o último foi superior no geral. Além disso, os resultados demonstraram que o ensaio RT-LAMP foi 100 vezes sensível e 3 vezes mais rápido em comparação com RT-PCR. O ensaio LAMP foi realizado em banho-maria, livre de qualquer máquina termocicladora ou de instalações laboratoriais sofisticadas. Enquanto isso, entre seis corantes visuais diferentes para detectar com precisão os produtos IC–RT-LAMP, o azul de hidroxinaftol, o GeneFinder ^TM e o SYBR Green I puderam produzir uma mudança de cor e brilho longa e estável em uma abordagem baseada em tubo fechado para evitar o risco de contaminação cruzada, concluídos eventualmente como os melhores. Portanto, propomos este ensaio colorimétrico como um sistema alternativo de reconhecimento viral altamente confiável em relação ao reconhecimento de PVY e provavelmente outras doenças de base viral.