Tecnologia Genética

Abstrato

Caracterização de domínios proteicos monoméricos que se ligam especificamente a um alvo de ADN altamente conservado de 100 Bp em genes de ARNr

Elodie Carnus, Marie-Véronique Demattei, Sophie Casteret, Guillaume Carpentier, Fabien Palazzoli, Solenne Bire, Christophe Bressac e Yves Bigot

As provas de conceito mostraram que os agrupamentos de genes cromossómicos que codificam o RNA ribossómico (rRNA) constituem loci de integração de entrega de genes que são ideais para a expressão de transgenes. No entanto, como a recombinação homóloga é eficiente para integrar segmentos de ADN nestes genes em animais, são necessárias novas ferramentas moleculares para construir sistemas capazes de atingir moléculas na vizinhança imediata dos genes de ARNr.

 Investigámos as propriedades de vários domínios de ligação ao ADN (DBDs) capazes de reconhecer especificamente um motivo dentro de uma região de 100 pb dos genes de ARNr que é 99-100% conservada entre eucariotas. As nossas descobertas demonstram que dois DBDs Myb-like originários das endonucleases codificadas por retrotransposões R2 não-LTR são candidatos promissores, uma vez que i) reconhecem especificamente, com elevada afinidade, um sítio de ligação de 20 pb localizado dentro do alvo de rDNA genómico esperado , ii) atuam como monómeros, iii) contêm um sinal de localização nuclear, iv) mantêm-se funcionais quando fundidos a outro domínio e, v) não alteram a funcionalidade da proteína à qual estão fundidos. No entanto, os resultados obtidos in vivo com várias fusões de R2DBD revelam que duas propriedades ainda precisam de ser projetadas antes que estes DBDs possam ser integrados num sistema de direcionamento molecular direcionado para os genes de ARNr. A primeira diz respeito à capacidade do R2DBD se localizar no interior do nucléolo, a organela na qual residem os genes do ARNr. A segunda é a tendência do R2DBD para se acumular em certas partes dos núcleos, o que limita a sua difusão dentro dos núcleos. São discutidas soluções para contornar estas limitações atuais. Precisarão de ser analisados ​​mais detalhadamente sob três aspetos; as vantagens inexploradas dos R2DBDs, as possibilidades e limitações dos peptídeos de fusão para direcionar integrações de vetores não virais e as alternativas aos peptídeos de fusão para direcionar vetores.