Bioquímica e Bioquímica Analítica

Abstrato

Congresso de Biotecnologia 2015: Cisteína quimicamente modificada em processos fed-batch e impacto na produtividade específica de CHO - Aline Zimmer Merck Millipore

Aline Zimmer

O cultivo industrial em lote alimentado a partir de células de mamíferos é utilizado para a produção de proteínas terapêuticas, como os anticorpos monoclonais. Para além do meio que garante o crescimento inicial, a alimentação é necessária para melhorar o crescimento, a viabilidade e a produção de anticorpos. Os sistemas comerciais estabelecidos incluem uma alimentação principal concentrada ligeiramente ácida e uma alimentação separada de aminoácidos alcalinos contendo L-tirosina e L-cisteína. Uma vez que a L-cisteína não é estável devido à sua dimerização em cisteína na presença de ar e catalisadores metálicos, é necessário um derivado de L-cisteína estável para incluir todos os aminoácidos em alimentações de pH neutro. Estes sistemas de alimentação única são os preferidos para simplificar os esquemas de alimentação e melhorar a robustez global do processo através da estabilização dos sinais de pH e OD. Aqui, sugerimos a utilização de uma cisteína quimicamente modificada em combinação com sal dissódico de tirosina fosforosa num processo industrial de alimentação única alimentado em batelada aplicável em pequena escala, bem como em biorreatores. As experiências de cultura celular foram realizadas em tubos rotativos ou em biorreatores com uma linha celular em suspensão CHO expressando um anticorpo monoclonal humano. A densidade e viabilidade de células viáveis ​​foram medidas através de um dispositivo automático de contagem de células. A análise dos sobrenadantes do meio gasto foi realizada para aminoácidos após derivatização pré-coluna e análise UPLC e para vitaminas utilizando LC-MS/MS.

As medições dos metabolitos foram realizadas com o Cedex Bio HT com base em métodos fotométricos e turbidométricos. A caracterização do anticorpo monoclonal foi realizada utilizando a marcação 2-AB para as análises de glicano, cIEF para as análises de variantes de carga e LC-MS/MS para as experiências de mapeamento de péptidos. Estudos de estabilidade do alimento contendo o derivado de cisteína modificado mostraram que a molécula era estável e que não foi libertada L-cisteína ou L-cistina durante três meses quando armazenada à temperatura ambiente ou a 4 °C. Além disso, não foi observada qualquer alteração na cor da ração ao longo do tempo. Experiências de pequena escala em lotes onde a L-cisteína foi substituída pela mesma quantidade de cisteína quimicamente modificada não indicaram qualquer alteração nos perfis de crescimento ou na viabilidade. A utilização do derivado de cisteína modificado em processos descontínuos alimentados em pequena escala indicou uma densidade celular viável máxima comparável, viabilidade prolongada e título aumentado em comparação com o sistema de duas alimentações estabelecido.

As experiências em biorreatores confirmaram o aumento da produtividade específica descrito em pequena escala quando a estratégia de alimentação única foi comparada com as duas estratégias de alimentação. A caracterização aprofundada do anticorpo monoclonal não indicou qualquer alteração na glicosilação ou no padrão variante de carga, enquanto as experiências de mapeamento de péptidos não foram capazes de detectar qualquer integração do aminoácido modificado na sequência do anticorpo monoclonal. O cuidado dos mamíferos com as formas aglomeradas para a criação do neutralizador monoclonal (mAb) depende do cuidado necessário de alguns suplementos, como a glicose, nutrientes e aminoácidos para prolongar o tempo de cultura e melhorar a produção de proteínas[1]. a L-tirosina são tratadas independentemente a pH solúvel devido ao seu baixo equilíbrio e baixa solvência a pH neutro, provocando picos de pH e precipitação [2]. Para melhorar as formas mais avançadas, ambos os aminoácidos foram alterados artificialmente para melhorar os seus perfis específicos de solidez e dissolubilidade. Trabalhos anteriores mostraram que o sal dissódico de fosfotirosina (PTyr2Na) é um subordinado estável da L-tirosina e pode ser utilizado em tratamentos de pH independentes sem afetar de forma detetável a execução do estilo de vida ou os atributos de qualidade do mAb [3] . Aqui, apresentamos os resultados obtidos utilizando uma subsidiária de L-cisteína numa estrutura apartidária de pH e alimentação única.

A fiabilidade da subsidiária L-cisteína foi avaliada a pH independente, CellventoTM Feed-220 durante um quarto de ano à temperatura ambiente ou 4°C. O desenvolvimento foi realizado na estrutura de meios Cellvento™ CHO-220 conforme indicado na orientação do procedimento do item. Para os controlos, foram utilizadas Cellvento™ Feed-220 e uma alimentação básica diferente de cisteína/tirosina, embora no processo de alimentação única, a subsidiária L-cisteína e PTyr2Na tenham sido legitimamente solubilizadas no pH imparcial, alimentação primária. Os ensaios foram realizados em tubos rotativos e biorreatores de 1,2L. O desenvolvimento e a razoabilidade foram observados utilizando um ViCell®, o título foi resolvido utilizando Cedex Bio HT e a rentabilidade explícita foi determinada em função do título, espessura celular viável necessária e enfraquecimento.

Para a investigação do meio gasto, a medição subsidiária de L-cisteína e amino corrosiva foi realizada por UPLC utilizando o reagente AccQ·TagTMUltra. Para avaliar a capacidade de resposta da ração, foi adicionado H2DCFDA ao pH apartidário, Cellvento™ Feed-220 melhorado ou não com o subordinado. Para avaliação das espécies responsivas intracelulares, as células foram marcadas com carboxi-H2DCFDA e a fluorescência foi estimada. Para avaliar o limite das células para utilizar a subsidiária, os lisados ​​celulares foram enriquecidos e os itens moldados foram avaliados por UPLC. Para o exame do mAb, a N-glicosilação foi medida utilizando HPLC após marcação 2-AB, enquanto as variações de carga foram resolvidas utilizando cIEF.

A investigação do equilíbrio secundário da L-cisteína na alimentação com pH neutro não demonstrou qualquer alteração na fixação subordinada nem na descarga de L-cisteína/L-cistina quando armazenada durante mais de um quarto de ano à temperatura ambiente ou 4°C. Não foi observada precipitação ou alteração de sombreamento mostrando que o subordinado estava estável nas condições testadas. Cuidar do desenvolvimento do grupo em tubos alternados com o procedimento de alimentação única resultou em viabilidades finais mais elevadas, levando a títulos finais atualizados quando comparado com a condição de controlo. Os resultados do tubo rotativo foram confirmados em biorreatores, gerando maiores viabilidades finais, títulos expandidos e maior rentabilidade explícita com a metodologia de alimentação única.

A oxidação de cor mais baixa foi estimada após a expansão do H2DCFDA para pH imparcial, Cellvento™ Feed-220 contendo o subordinado contrastou com a alimentação isoladamente mostrando menor potencial recetivo. A menor oxidação da cor intracelular foi identificada pela expansão do carboxi-H2DCFDA para transformar o tubo de alimentação única em sociedades de grupo que apresentam menor idade das espécies receptivas intracelulares quando se utiliza o subordinado. No momento em que foi adicionado aos lisados ​​celulares, foi utilizada a cisteína subordinada em relação à cisteína. Não foi reconhecida qualquer distinção na N-glicosilação ou variação de carga no mAb entregue, demonstrando nenhum impacto da subsidiária nas características básicas de qualidade introduzidas. Este exame mostra que a subsidiária L-cisteína e PTyr2Na podem ser incorporadas num tratamento de pH independente e podem ser utilizadas como fonte de L-cisteína em formas de cluster tratadas, levando a um melhor desempenho explícito em comparação com o melhor processo da classe sem influenciar as propriedades básicas de qualidade do mAb.